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干货分享|流式手机术常见样本的制备与保存

作者:小科    发布日期:2021-03-15 09:00



流式手机术(flow cytometry, FCM)是当代最先进的手机分析技术之一,包括各种手机的计数、手机中抗原分子的检测、手机中DNA和RNA的倍体分析、手机的u乐学特性及功能分析等。在血液学检测中,应用FCM分析的样本多为外周血、骨髓、各类体液(如脑脊液、胸水、腹水)以及人体的组织(如u乐结、脾、肝等),下面我们将介绍这几种常见样本的制备方法,样本制备的好坏对最终的检测结果有很大影响。

 

外 周 血 或 骨 髓

1. 保存方法

收集样本后置于加有抗凝剂(一般选择肝素或EDTA)的试管中,室温保存,尽量在12 h内处理样本;若无法及时处理,4℃保存,此时最好选择肝素抗凝管。


2. 处理方法

一般不需要特殊处理制备单手机悬液,所用下载为u乐手机分离液和红手机裂解液。但在临床检测中,为了避免手机成分丢失,通常不推荐使用u乐手机分离液分离单核手机。


3. 抗凝剂的选择

血液标本可以使用EDTA、ACD(枸橼酸葡萄糖)或肝素抗凝。

一般认为,ACD和肝素抗凝的样本72 h内手机是稳定的;EDTA抗凝48 h内是稳定的,但超过24 h则认为不是很好了。

EDTA适用于白手机的免疫表型分析,可防止成熟的髓系手机贴壁造成手机损失,并具有较强的抗血小板凝集能力,但对手机活性的保持不如肝素抗凝。同时EDTA是二价阳离子的强螯合剂,会影响与Ca2+相关的抗原位点(如CD11b等),并会抑制与Ca2+相关的手机功能。肝素常用于白手机功能研究,可维持Ca2+和Mg2+在手机内的生理浓度,更好保持手机活性,适用于放置时间较长、不能及时检测的样本,但不适合血小板的相关检测。

骨髓样本优先选择肝素抗凝。
 

体  液

1. 保存方法

收集样本后置于肝素抗凝管中,室温保存,尽量在12 h内处理样本;若无法及时处理,4℃保存,保存时间最好不要超过48 h。

2. 处理方法

a. 样本1000-1500 rpm离心5 min,弃去上清;

b. 加入含有0.1%牛血清白app的磷酸盐缓冲液(PBS),离心洗涤5 min;
c. 加入适量PBS重悬。如有细小沉淀,用300目尼龙网过滤后备用。


组  织

1. 保存方法

切取新鲜组织样本置于生理盐水或PBS中,室温保存,尽量在12 h内处理样本;若无法及时处理,4℃保存,保存时间最好不要超过48 h。不建议用甲醛、乙醇固定手机,不要用酶、表面活性剂处理手机。


2. 处理方法

常用的组织样本制备单手机悬液方法有:机械法、酶处理法、化学下载处理法及表面活性剂处理法,在流式分析中,为保持抗原活性,多采用机械法处理样本。采用机械法需注意动作轻柔,尽量减少手机的损伤。

若实验室无单手机制备仪,手工剪切制备单手机悬液:

a. PBS清洗组织样本,去除大量红手机;

b. 用眼科剪将组织剪成极小块,再次PBS清洗;

c. 组织小块加入匀浆器中,加少量PBS匀浆;

d. 用细注射针头抽取手机悬液;

e. 300目尼龙网过滤;

f. 加入含0.1%牛血清白app的PBS;

g. 1000-1500 rpm离心5 min,弃去上清;

h. 加入适量PBS重悬。

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